1996年，他在上海戏剧学院出演了个人首部话剧《借我一个男高音》。1997年，于和伟去了南京军区前线话剧团。

1999年，参演个人首部电视剧《曹操》，从而正式进入演艺圈。2000年，出演都市情感剧《深圳女人》。2002年，出演苏舟执导的反腐剧《省委书记》；同年，出演都市喜剧《王记大排档》，在剧中饰演王记排挡的厨师西瓜。

2003年，在高希希执导的抗战剧《历史的天空》中饰演任军分区副政委万古碑；同年，出演近代传奇剧《大宅门2》，在剧中饰演白景琦孙子白占安。

2004年，于和伟与李雪健、殷桃联袂主演情感伦理剧《搭错车》，在剧中饰演阿美的亲生父亲苏民生；12月20日，其参演的抗战剧《追日》播出，在剧中饰演日本人木村一郎；同年，出演抗战剧《敌后武工队》。

2006年10月12日，与侯勇、丁志诚、殷桃等人合作主演的都市情感剧《真情年代》在中国中央电视台电视剧频道播出，于和伟在剧中饰演循规蹈矩的知识分子李和平；12月，出演严敏求、许亚军联袂主演的家庭伦理剧《孝子》播出，他在剧中饰演谢言的丈夫沈致公；12月13日，于和伟与许晴、殷桃、王伯昭等人共同出演的都市商战剧《局中局》播出，于和伟在剧中饰演赵天宇的孪生哥哥周英文。

2007年，出演高希希执导的伦理情感剧《男人底线》，在剧中饰演阴冷顽固的赵通达；之后，于和伟在吴君如主演的爱情喜剧《我爱芙蓉姐》中饰演广告公司总经理常青；4月6日，其参演的抗战剧《霓虹灯下的哨兵》播出，在剧中饰演前线文工团演员郝铁蛋；同年，在郑方南执导的军旅爱情剧《战地浪漫曲》中饰演心肠好的唐副司令。

2008年11月22日，主演高希希执导的年代情感剧《纸醉金迷》，他在剧中饰演的投机倒把的奸商范宝华。11月23日，与马伊琍合作主演的都市情感剧《锁春记》播出，于和伟在剧中饰演商界精英庄世博；11月25日，主演的情感剧《漂亮的事》在中央电视台电视剧频道播出，他在剧中饰演国有企业的副厂长江百川；12月4日，出演的都市悬疑剧《面具》播出，他在剧中饰演身价数千万，业内翘楚的著名精神心理学博士常思远；此外，他还出演了年代革命剧《光荣岁月》；同年，主演刑侦剧《华容道》，在剧中饰演南华的老板郭林。

2009年6月，凭借电视剧《纸醉金迷》入围第15届上海电视节白玉兰奖最佳男演员奖。2010年5月2日，与陈建斌、陆毅、倪大红合作主演的古装剧《三国》播出，在剧中饰演三国时期蜀汉开国皇帝刘备；7月11日，与胡军、梅婷合作出演的都市情感剧《岁月》在北京卫视播出，他在剧中饰演性格善良的现代机关干部吴过；9月6日，主演的年代战争剧《家仇》在东方卫视播出，于和伟在剧中饰演个性冷静凶残多变、老谋深算的军阀张天心；9月20日，与侯勇、唐文龙联袂主演的抗战剧《特战先锋》播出，他在剧中饰演军统局二号人物毛人凤；10月20日，其参演的近代革命剧《冰是睡着的水》播出，他在剧中饰演敌对组织的特工周新宇；12月，与林永健、何赛飞共同主演的都市情感剧《老马家的幸福往事》播出，他在剧中饰演的莫文辉，为了不再过无家可归的生活，他放弃自己心爱的女人马拉，又用一生为了爱情赎罪；随后，与罗海琼搭档主演的都市情感剧《幸福在路上》，于和伟在剧中饰演相貌英俊、性格豪爽的军区参谋马刚。

2011年，凭借电视剧《幸福在路上》获得南方盛典最佳男演员奖；3月18日，主演的年代谍战剧《青盲》播出，他在剧中饰演有勇有谋、代号“青盲”的共产党王牌特工张海峰；5月16日，与谷智鑫、李沁、徐百卉等人合作主演的近代革命剧《中国1921》播出，他在剧中饰演任北京大学文科学长的陈独秀；10月19日，主演的谍战剧《兵临城下》上星播出，于和伟在剧中饰演的杨少诚，想扛枪打仗的热血青年，因祖业岌岌可危，被逼无奈扛起了振兴家业的重托。

2012年2月29日，其作为嘉宾参加的娱乐访谈节目《非常静距离》播出；5月22日，获得MSN星月年度最具价值男演员奖；6月10日，与佟瑞欣、赵恒煊、海顿等人合作主演的谍战剧《奸细》在山东电视台影视频道播出，他在剧中饰演军统关州总负责人江一平；6月25日，主演的都市情感剧《男人的战争》播出，在剧中饰演冶金大院三兄弟之首唐季山；10月1日，其参演的军旅剧《我是特种兵之利刃出鞘》播出，于和伟在剧中饰演铁拳团团长康雷；10月22日，与王丽坤合作主演的抗战剧《连环套》播出，他在剧中饰演中共地下党孟庆凡；11月7日，与刘威葳、刘钧联袂主演的家庭情感剧《大家庭》在中央电视台综合频道播出，于和伟在剧中饰演的袁刚，诚恳仗义，是70年代末拖家带口的回城知青；12月28日，参演的古装武侠剧《楚汉传奇》播出，于和伟在剧中饰演中国第一代皇帝秦始皇。

2013年2月4日，于和伟与杨童舒、李依晓、霍青等人共同主演的家庭伦理剧《天下人家》播出，他在剧中饰演入殓师唐中秋；12月15日，与王丽坤搭档主演的抗战剧《零下三十八度》在东方卫视上星播出，于和伟在剧中饰演诈死隐居的国民党特工年定邦。

2014年4月28日，与王丽坤合作主演的都市时尚情感剧《爱的多米诺》播出，他在剧中饰演玩具设计师戴谷顺；8月14日，于和伟与刘涛、邵汶联袂主演的都市情感剧《下一站婚姻》播出，他在剧中饰演转业特种兵龚箭，其后，他凭借该剧获得了第17届华鼎奖当代题材最佳男演员奖；同年，他还主演了刑侦剧《刑警队长》，于和伟在剧中饰演的刑警队长顾铭，不仅率领队友屡破大案保卫城市安全，还是一位爱妻儿孝顺父母的好男人。

2015年1月，与刘欢、叶璇联袂主演抗战剧《搜索连》，在剧中饰演师长吴休葆；4月15日，于和伟与何晟铭、白冰联袂主演的都市情感剧《婚前协议》上星播出，他在剧中饰演时装设计公司董事长高寒；5月25日，与祖峰、叶一云、张延合作主演的刑侦剧《刑警队长》，于和伟在剧中饰演的顾铭，既是智勇双全、刚柔并济的“人民卫士”，也是一位拥有着敏锐洞察力、坚忍耐力、执着信念的刑警队长；9月，与侯梦莎、黄梦莹、金美伶等人合作出演的现代青春励志剧《警花与警犬》开机，于和伟在剧中饰演的杜飞，在刑侦工作岗位上勇于担当，明察秋毫，具备良好的职业素质和过硬的侦查能力；随后，他还出演了贺岁片《过年好》；12月23日，作为嘉宾出席了第30届中国电视剧飞天奖典礼；12月24日，与冯小刚、张涵予、许晴合作出演的剧情片《老炮儿》上映，于和伟在片中饰演温柔中带着霸气的龚叔。

2016年1月15日，与黄渤、孙红雷、黄磊等人合作主演的喜剧片《极限挑战》上映，他在片中饰演明朝皇帝永历帝；3月，主演古装权谋剧《大军师司马懿之军师联盟》，在剧中饰演进可金戈铁马，退可赋诗歌怀的枭雄曹操；5月15日，与朱雨辰、李小冉共同出演的年代谍战剧《追击者》播出，于和伟在剧中饰演军统特工曹若飞；7月22日，其出演的悬疑片《魔都凶音》上映，他在片中饰演史总；11月18日，与范冰冰、郭涛合作主演的剧情片《我不是潘金莲》上映，饰演新任县长郑重；同年，主演都市情感轻喜剧《下一站，别离》，在剧中饰演成熟稳重、低调务实的公司高管秋阳。

2017年，于和伟担纲艺术总监并领衔主演刑侦缉毒剧《猎毒人》，在剧中饰演滨江市飞鹏生物化学科技研究室创始人吕云鹏；7月27日，其出演的革命史诗片《建军大业》上映，于和伟在片中饰演时任中共中央总书记陈独秀；9月16日，凭借电影《我不是潘金莲》获得第31届中国电影金鸡奖最佳男配角；11月28日，其参加录制的阅读推广季播节目《见字如面第二季》在黑龙江卫视播出；12月，于和伟凭借其主演的电视剧《大军师司马懿之军师联盟》获得第8届澳门国际电视节最佳男配角提名以及中国年度新锐榜年度艺人。

2018年，凭借电视剧《大军师司马懿之军师联盟》获得第24届上海电视节举行“白玉兰奖”最佳男配角；4月16日，为电视剧《下一站，别离》演唱的插曲《青春告别诗》正式上线；4月28日，其参演的犯罪悬疑片《幕后玩家》上映；之后，凭借电视剧《刑警队长》、《大军师司马懿之军师联盟》入围第31届中国电视剧飞天奖优秀男演员奖；6月，以飞行嘉宾身份参加了湖南卫视生活服务纪实节目《向往的生活第二季》；7月15日，其作为飞行嘉宾参加的励志体验真人秀节目《极限挑战第四季》在东方卫视播出；7月20日，其参演的现代探险剧《沙海》在腾讯视频播出，他在剧中饰演吴邪的三叔吴三省 ；8月10日，其参演的电影《一出好戏》上映；9月，其作为飞行导师参加的演技竞演类励志综艺节目《我就是演员》播出；10月14日，凭借电视剧《大军师司马懿之军师联盟》入围中国电视金鹰奖观众喜爱的男演员奖；11月，与雷佳音、杨幂、董子健合作主演的悬疑片《刺杀小说家》杀青。

2019年3月5日，获得电视剧品质盛典活动年度实力演技剧星；4月8日，其特约主演的古装神话剧《封神演义》播出，于和伟在剧中饰演周朝开国丞相姜子牙；9月7日，获得第十七届电影表演艺术学会奖。