1978年初，吴晓东考入河北省艺术学校话剧班。此后，他进入了承德话剧团工作。在此期间，吴晓东随剧团先后排演了十余部话剧，并在北京、河北、辽宁等地进行了上千场演出。

1980年，主演北京电视台拍摄的电视剧《结婚现场会》，饰演男主角郑云山，而这是其第一次涉足影视表演。

1984年，开始与众多演员共同出演古典名著剧《红楼梦》，其在剧中饰演了斯文清秀、聪明伶俐的贾府近支子弟贾芸，而除了演员身份外，他还在此后三年的拍摄过程中担任了剧组的场记一职。

《红楼梦》杀青后，吴晓东报考了中央戏剧学院，并于1987年以全国专业课第一名的成绩考入了该学院的导演系。毕业后，他则被分配到了中国青年艺术剧院（中国国家话剧院）工作。

1990年，吴晓东开始与众多演员共同出演由王扶林任总导演、改编自同名古典名著的古装剧《三国演义》，其在剧中分饰了知人善任却又性多嫌忌，三分天下有其一的吴大帝孙权，以及孙策与孙权的父亲、江东之虎孙坚，而在该剧的拍摄过程中他也担任了剧组的执行导演。

1997年，其与孙彦军、陆树铭等共同主演的古装历史人物剧《孙武》播出，剧中他饰演了一度成为天下霸主，却最终身死国灭的吴国君主夫差。2000年，在张国立执导的清装戏说剧《康熙微服私访记3》中饰演了阴险狡猾的两江总督噶礼。2004年，吴晓东执导了都市情景剧《幸福生活》。

2007年，主演根据诺贝尔文学奖得主萨拉马戈作品改编的话剧《失明的城市》，其在剧中饰演的是博尔医生。同年，他还在话剧《奇异的插曲》饰演了达莱尔医生。

2009年，吴晓东与邓超、安以轩等人联袂出演的金庸武侠剧《倚天屠龙记》播出，其在剧中饰演的杨逍，相貌俊雅却又冷峻孤傲，他是明教的光明左使，也是逍遥二仙之一。

2010年，受法国卡斯塔剧院和法国驻华文化处的邀请，吴晓东前往法国排演话剧《仙境指南》，并在剧中饰演一位学者，此剧参加了中法文化之春艺术节，并在北京国家大剧院及上海、昆明等地演出。同年，吴晓东与吴秀波、林永健、海清等联袂主演的谍战剧《黎明之前》播出，其在剧中饰演的是医务处长马蔚然。

2011年，再次与孙彦军、陆树铭等人合作，出演古装神话剧《香山奇缘》；同年，战争历史剧《中国1945之重庆风云》播出，吴晓东在剧中与张国立、唐国强合作，饰演了著名将领张治中。

2012年，主演话剧《理查三世》的中国版，在剧中饰演公爵勃金汉。同年，出演现代剧《拯救—戒毒所日记》，饰演艺术家陆楠。

2015年，与导演刘江合作执导谍战剧《黎明决战》。2016年，执导生活剧《主妇也要拼》，该剧于次年5月播出。2017年6月17日，参加电视剧《红楼梦》开播30周年再聚首纪念音乐会。2018年，执导的电影《熊猫石的奇幻旅行》上映。

2020年10月18日，主演的民国动作版电影《燕子盗》在沈阳关东影城开机。

2021年5月25日，参演的重大革命历史题材剧《光荣与梦想》在北京卫视和东方卫视播出。10月22日，革命题材电视剧《前行者》播出，饰演鹿友祥。