1985年，李幼斌进入长春电影制片厂，并主演电影《死证》，27岁的他饰演一位40多岁的东北抗日联军的师长。1987年，李幼斌在电影《天谷》中担任男主角。1988年，李幼斌在自己的第一部电视剧《她曾经是我的妻子》中扮演主角。1994年，在电视剧《潮起潮落》中饰演主角鲁明宽。

2000年，在《非常代价》中饰演马超。参演电影《横空出世》。2004年在电影《惊涛骇浪》中饰演张子明，获得第9届华表百花最佳男演员奖提名。 2005年在电视剧《亮剑》中饰演李云龙，与童蕾、何政军、张光北等人合作。获得第23届中国电视金鹰奖观众喜爱的男演员奖 。

2006年，主演《闯关东》，与萨日娜、刘向京、朱亚文等人合作。2007年，在电视剧《仁者无敌》中饰演皮德贵。2009年，根据红色经典巨著《红日》改编的同名电视剧开播，李幼斌在剧中出演国民党高级将领张灵甫。

2010年，在谍战剧《旗袍》中饰演钱鹏飞，与马苏、王志文合作。同年在夏雨主演的电视剧《师傅》中饰演老铁。2011年，在《国门英雄》中饰演关汉生，与史兰芽、张志坚、田子田合作。2012年，参演《老严有女不愁嫁》，饰演的是爱女如命，对未来女婿挑剔万分的倔强岳父。 2013年，主演电影《雷锋的微笑》，与万思维、唐国强等人合作。同年在《爱的保镖》中饰演孙海山。10月，主演悬疑剧《别让我看见》，饰演老刑警刘玉生。2014年5月，在家庭轻喜剧《孙老倔的幸福》中，饰演孙老倔。9月，主演谍战剧《邮差》。2015年3月，在《决战江桥》饰演抗战英雄马占山将军。 2017年11月，主演主旋律电影《中国企业家》。

2019年6月26日，李幼斌、史兰芽夫妻首次共同出演话剧《老式喜剧》在北京人艺实验剧场首演。 同年9月，特别出演的战争电影《九条命》发布了首支先导预告片；10月16日，与张明健、李君峰、吴其江等合作主演的抗战剧《一马三司令》首播。2020年9月30日，参加2020央视国庆晚会《“中国梦·祖国颂”——2020国庆特别节目》，讲述《从长江畔到黄鹤楼》。