1983年，在剧情电影《闯江湖》中扮演丑角艺人张乐天，正式开始演艺生涯。

1985年，主演剧情影片《流浪汉与天鹅》，在片中饰流浪汉抹桌，表演朴实幽默，生活气息浓郁。

1987年，在黄蜀芹执导的剧情影片《人鬼情》中扮演女艺人秋芸的父亲，这是一个性格复杂的人物，长期精神压抑而形成倔强，固执但又争强好胜的性格特色，凭借该片获得1988年第8届中国电影金鸡奖最佳男配角奖。

1990年，与赵丽蓉、葛优、六小龄童主演家庭剧情电影《过年》，在片中饰演儿女成群的父亲，但他仍然生活在极度的烦恼之中，鲜明的表演风格给观众留下深刻的印象，该片获得《大众电影》百花奖最佳故事片奖及第4届东京国际电影节评委特别奖。

1991年，首次导演张艺谋合作，主演其执导的剧情电影《菊豆》，在片中饰演一个饱受压抑与婶子偷情的男人杨天青，该片获得第43届法国戛纳电影节特别奖、芝加哥国际电影节金雨果奖。

1992年，在剧情电影《葛老爷子》中饰演一个年逾七旬的老人，凭借该片获得第8届中国电视剧飞天奖最佳男主角奖，同时该片获得长春电影节最佳影片金奖。

1993年，领衔主演剧情电影《凤凰琴》，在片中饰演山区民办教师余校长一角，表演生动感人，获得当年的政府奖、百花奖、金鸡奖三个奖项的最佳男主角奖。

1995年，再度和导演张艺谋合作，在剧情电影《摇啊摇，摇到外婆桥》中饰演三十年代上海滩黑社会头目唐老大一角，这是李保田从事电影表演十多年第一次饰演反面角色；同年，领衔主演历史题材古装剧《宰相刘罗锅》，在剧中饰演刚正不阿、不畏权贵、机智幽默的刘罗锅，深受观众喜爱，凭借该剧获得第14届中国电视金鹰奖最佳男主角。

1996年，三度和张艺谋合作，出演电影《有话好好说》中一个憨厚、老实、懦弱滑稽的中年男人老张（张秋生）；同年，与张延、盖克共同主演情感电影《离婚了，就别再来找我》，在片中饰演一个怀才不遇，处在不幸之中的作家李浩明。

1999年，与黄宗洛合作主演家庭轻喜剧《万家轶事》，在剧中饰演万明；同年，在电视剧《村主任李四平》中饰演生活在社会的最低层李四平；同年，主演电视剧《生死两周半》。

2001年，领衔主演古装商战剧《大清药王》，在剧中饰演民间药王乐阔海。

2003年，领衔主演的古装传记电视剧《神医喜来乐》播出，在剧中饰演医术高明，为人善良耿直，不屈不饶的沧州神医喜来乐，凭借在该剧中的经典表演，获得第23届中国电视剧飞天奖优秀男演员奖，第21届中国电视金鹰奖最佳表演艺术男演员奖、最具人气男演员奖、观众最喜爱的男演员奖等多个奖项；同年，领衔主演电视剧《王保长新篇》。

2006年，领衔主演剧情电影《马背上的法庭》，在片中饰演年迈执着，有责任感的法官老冯。

2007年，领衔主演电视剧《王保长新篇2死去生来》。之后淡出影视行业，之后在清装诉讼剧《南北大状》中重新复出。

2010年，主演一部表现父女情深的都市亲情伦理剧《丑角爸爸》，在片中表现了戏曲演员为传承京剧艺术，在困境中挣扎跋涉、苦苦探求、执着坚守的责任意识和崇高品德。

2013年，主演继《神医喜来乐》十年后再续前缘的新篇新传《神医喜来乐传奇》，在剧中饰演医术高超的民间郎中喜来乐；同年，主演中法合拍电影《夜莺》，凭借该片获得电影频道传媒大奖最佳男主角，中澳国际电影节最佳男演员等多个奖项。

2015年，参演马志刚执导的抗战剧《义道》，在剧中饰演张家口首屈一指的商号“鼎兆通”掌舵人秦兆通；12月11日，参演安战军执导的爱情电影《北京时间》，在片中饰演建筑队长。

2020年10月18日，获得第30届中国电视金鹰奖终身成就电视艺术家奖。

2021年5月，领衔主演唐大年担任导演的喜剧电影《寻汉计》，饰演姥爷。