1973年，曹翠芬离开了稻田，走进了北京电影制片厂，并参演了个人首部电影《南征北战》 。

1976年，与胡静、李百万联合出演剧情电影《牛角石》。1977年，由其参演的动作剧《黑三角》播出。1979年，与陈佩斯、陈强联合出演家庭情感剧《瞧这一家子》，在片中饰演深爱儿子的善良母亲 。

1980年，与李羚等联袂主演儿童电影《苗苗》。1981年，参演的儿童电影《风帆》上映。1984年，由其出演的剧情电影《生财有道》上映；同年，与李连义共同主演剧情电影《跳动的火焰》。1986年，参演由马秉煜执导的剧情电影《你的微笑》。

1987年，与沈丹萍、马崇乐联合出演剧情电影《女人国的污染报告》。1990年，与巩俐、何赛飞联袂出演剧情电影《大红灯笼高高挂》，在片中饰演表面对人温柔热情，暗地里却是阴险狡诈的第二房太太卓云 ，她凭借该片获得第4届中国电影表演艺术学会金凤凰奖表演学会奖。

1992年，与郭少雄合作主演剧情电影《杂嘴子》，在片中饰演民生的妈妈淑英 ，她凭借该片获得第6届中国电影童牛奖优秀成人奖 。1993年，由其出演的家庭剧《上海一家人》上映 ，她凭借该剧获得第12届中国电视剧飞天奖最佳女配角奖 。1995年，与高强合作主演剧情电影《孤儿泪》，在片中饰演善良的地道农妇耿二女 ，她凭借该片入围第16届中国电影金鸡奖最佳女主角奖 ，获得第2届中国电影华表奖最佳女主角奖。

1998年，由其参演的古装剧《穆桂英大破天门阵》播出；同年，参演古装剧《穆桂英十二寡妇征西》 ；此外， 还与吴冕、廖京生联合出演了家庭剧《蔷薇雨》。1999年，出演由霍建起执导的剧情电影《九九艳阳天》。2000年，与朱琳搭档主演剧情电影《黑色风景里的女人》。

2002年，出演由谢鸣晓执导的家庭伦理剧《平安是福》。2004年，由其出演的家庭都市剧《深度诱惑》播出 ；同年，与郭冬临、严晓频联袂主演家庭剧《女人不麻烦》，在剧中饰演有五个孩子的妇科医生樊淑芳 。2005年，与蒋勤勤、张静初联袂出演惊悚电影《七夜》 ；同年，参演由董志强执导的谍战剧《密令1949》；此外，还主演了爱情家庭电影《追赶我可能丢了的爱情》，在片中饰演俏生活泼，容光换发的秧歌队员石若玉。

2006年，出演由姚晓峰执导的情感剧《夜深沉》，该剧根据张恨水的同名小说改编 ；3月27日，与鲁园等共同出演的家庭情感剧《守望幸福》首播；同年，与黄觉合作主演家庭剧《甜蜜的烦恼》，在剧中饰演疼爱儿子的老太太陈玉英。2007年2月1日，由其参演的都市情感剧《廖家》播出。

2009年，出演以发生在沂蒙老区的孟良崮战役为背景的剧情电影《战争中的女人-沂蒙六姐妹》，她凭借该片入围第10届中国长春电影节最佳女配角奖 、第27届中国电影金鸡奖最佳女配角奖 ；3月17日，与高曙光、王姬联合出演的家庭伦理剧《老伴》播出，在剧中饰演思路敏捷、充满冲劲的普通小学老师林芝花 ；11月16日，与海清、张嘉译联袂出演都市爱情剧《蜗居》 。

2010年，与张国立等共同出演爱情剧《不如跳舞》。

2011年，与蒋雯丽、孙淳联袂主演爱情家庭剧《幸福来敲门》，在片中饰演善良却很传统的老人钱淑华 ；同年，由其出演的都市情感剧《爱你所以离开你》播出；11月8日，由其参演的爱情电影《失恋33天》上映；此外，还参演了爱情剧《婚姻密码》。

2012年，与咏梅、陈刚联合主演当代都市剧《儿女的战争》，在剧中饰演刘家后妈张长兰 。

2013年，出演由陈伟祥执导的家庭剧《那金花和她的女婿》 。

2014年，与史兰芽等共同主演现代剧《国家审计》 。

2017年，由其参演的医疗剧《外科风云》播出。

2018年，与赵丽颖、冯绍峰联合出演古装剧《知否知否应是绿肥红瘦》，在剧中饰演刚正不阿，是非分明的盛老太太，该剧改编自关心则乱同名小说 ；同年，与吴镇宇、董璇等联袂出演当代都市剧《慢慢地陪着你走》 。

2019年，出演电视剧《庆余年》，饰演范老太太 。

2020年6月，参演的电视剧《最美的乡村》播出 ；同年，主演家庭都市剧《嗨，什刹海》 ；9月，入围第七届中国电视好演员奖红组女演员名单 。10月20日，由中国视协演员工作委员会主办的第七届“中国电视好演员”网络投票结果公布，曹翠芬获得中国电视好演员优秀演员（红组女演员）。

2021年9月26日，参演的电视剧《熟年》宣布开机 ；10月18日，特别主演的古装爱情励志剧《嘉南传》在腾讯视频播出 。